تشخیص بیماری‌ها با استفاده از تکنیک Real-Time PCR یک روش بسیار دقیق و حساس برای تشخیص وجود و مقدار DNA یا RNA مشخصی در نمونه‌های بیولوژیکی است. در ادامه، به آموزش کامل این فرآیند می‌پردازیم:
۱. آماده‌سازی نمونه
قبل از هر چیز، نمونه مورد نظر (خون، بزاق، بافت، ادرار و غیره) باید به درستی جمع‌آوری شود. سپس مراحل زیر انجام می‌شود:
استخراج DNA یا RNA: استخراج اسید نوکلئیک از نمونه، اولین و مهم‌ترین گام است. این کار با استفاده از کیت‌های تجاری استخراج DNA/RNA انجام می‌شود که شامل مراحل لیز سلولی، جدا کردن اسید نوکلئیک و خالص‌سازی آن است.
۲. آماده‌سازی واکنش Real-Time PCR
برای انجام واکنش Real-Time PCR، به ترکیبات زیر نیاز است:
- پرایمر‌ها: قطعات کوتاهی از DNA که به توالی هدف متصل می‌شوند.
- پروب: قطعه‌ای از DNA یا RNA که دارای فلوروفور و خاموش‌کننده است.
- آنزیم Taq پلیمراز: آنزیمی که در دمای بالا فعالیت دارد و باعث تکثیر DNA می‌شود.
- مخلوط واکنش: حاوی بافر، نمک‌ها و dNTPها.
۳. تنظیم دستگاه Real-Time PCR
دستگاه‌های Real-Time PCR انواع مختلفی دارند، اما تنظیمات کلی آن‌ها به شرح زیر است:
- انتخاب برنامه حرارتی: شامل مراحل دناتوراسیون (۹۰-۹۵ درجه سانتی‌گراد)، اتصال (۵۰-۶۵ درجه سانتی‌گراد) و گسترش (۷۰-۷۵ درجه سانتی‌گراد) است. هر سیکل این مراحل تکرار می‌شود.
- تنظیم تعداد سیکل‌ها: معمولا بین ۳۰ تا ۴۵ سیکل انجام می‌شود.
۴. انجام واکنش
بعد از تنظیم دستگاه و آماده‌سازی مخلوط واکنش، مخلوط به داخل بلاک دستگاه اضافه شده و دستگاه روشن می‌شود. دستگاه Real-Time PCR در هر سیکل میزان فلورسانس تولید شده توسط پروب‌ها را اندازه‌گیری می‌کند.
۵. تحلیل نتایج
نتایج واکنش Real-Time PCR به صورت نمودارهای تکثیر (amplification curves) نمایش داده می‌شوند.
- Ct value: یا چرخه آستانه، چرخه‌ای است که در آن فلورسانس از یک مقدار آستانه عبور می‌کند. مقدار Ct با میزان اولیه DNA یا RNA هدف در نمونه رابطه معکوس دارد.
- کمی‌سازی: با استفاده از یک استاندارد شناخته شده، می‌توان مقدار دقیق اسید نوکلئیک هدف در نمونه را تعیین کرد.
۶. تفسیر نتایج
برای تفسیر نتایج Real-Time PCR به اطلاعات بالینی بیمار و تاریخچه پزشکی نیاز است. همچنین باید اطمینان حاصل کرد که نمونه‌ها به درستی جمع‌آوری، نگهداری و پردازش شده‌اند تا نتایج قابل اعتماد باشند.
نکات مهم:
- کنترل‌های مثبت و منفی: برای اطمینان از صحت آزمایش، از کنترل‌های مثبت (حاوی DNA یا RNA هدف) و کنترل‌های منفی (فاقد DNA یا RNA هدف) استفاده کنید.
- دقت در آماده‌سازی نمونه: هر گونه آلودگی در نمونه می‌تواند نتایج را تحت تأثیر قرار دهد.
- کالیبراسیون دستگاه: دستگاه Real-Time PCR باید به طور منظم کالیبره شود تا دقت و صحت نتایج تضمین شود.